Semua Tentang Pembatasan Enzim

Pembatasan endonukleas adalah kelas dari enzim yang memotong molekul DNA. Setiap enzim mengenali urutan unik nukleotida dalam untai DNA — biasanya sekitar empat hingga enam pasangan basa. Urutannya adalah palindromik karena untai DNA komplementer memiliki urutan yang sama dalam arah sebaliknya. Dengan kata lain, kedua untai DNA dipotong di lokasi yang sama.

Enzim restriksi ditemukan di banyak strain bakteri yang berbeda di mana peran biologis mereka adalah untuk berpartisipasi dalam pertahanan sel. Enzim ini membatasi DNA asing (virus) yang masuk ke dalam sel dengan menghancurkannya. Sel inang memiliki sistem modifikasi-pembatasan yang memetilasi DNA mereka sendiri di tempat-tempat spesifik untuk enzim restriksi masing-masing, sehingga melindungi mereka dari pembelahan. Lebih dari 800 enzim yang dikenal telah ditemukan yang mengenali lebih dari 100 urutan nukleotida yang berbeda.

Ada lima jenis enzim restriksi. Tipe I memotong DNA di lokasi acak sejauh 1.000 atau lebih pasangan basa dari situs pengenalan. Tipe III memotong sekitar 25 pasangan basa dari situs. Kedua jenis ini membutuhkan ATP dan dapat berupa enzim besar dengan banyak subunit. Enzim tipe II, yang sebagian besar digunakan dalam bioteknologi, memotong DNA dalam urutan yang dikenali tanpa perlu ATP dan lebih kecil dan lebih sederhana.

Enzim restriksi tipe II diberi nama sesuai dengan spesies bakteri dari mana mereka diisolasi. Sebagai contoh, enzim EcoRI diisolasi dari E. coli. Sebagian besar masyarakat mengenal E. wabah coli dalam makanan.

Enzim restriksi tipe II dapat menghasilkan dua jenis pemotongan berbeda tergantung pada apakah mereka memotong keduanya helai di tengah urutan pengakuan atau masing-masing helai lebih dekat ke salah satu ujung pengakuan urutan.

Potongan sebelumnya akan menghasilkan "ujung tumpul" tanpa overhang nukleotida. Yang terakhir menghasilkan ujung "lengket" atau "kohesif" karena setiap fragmen DNA yang dihasilkan memiliki overhang yang melengkapi fragmen lainnya. Keduanya berguna dalam pembuatan genetika molekuler DNA rekombinan dan protein. Bentuk DNA ini menonjol karena diproduksi oleh ligasi (ikatan bersama) dari dua atau lebih untai yang berbeda yang pada awalnya tidak saling terkait.

Enzim tipe IV mengenali DNA teretilasi, dan enzim Tipe V menggunakan RNA untuk memotong urutan pada organisme penyerang yang tidak palindromik.

Enzim restriksi digunakan dalam bioteknologi untuk memotong DNA menjadi untaian yang lebih kecil untuk mempelajari perbedaan panjang fragmen di antara individu. Ini disebut sebagai polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP). Mereka juga digunakan untuk kloning gen.

Teknik RFLP telah digunakan untuk menentukan bahwa individu atau kelompok individu memiliki perbedaan khas dalam urutan gen dan pola pembelahan restriksi di area genom tertentu. Pengetahuan tentang bidang-bidang unik ini adalah dasar untuk Sidik jari DNA. Masing-masing metode ini tergantung pada penggunaan elektroforesis gel agarosa untuk pemisahan fragmen DNA. Buffer TBE, yang terdiri dari basa Tris, asam borat, dan EDTA, umumnya digunakan untuk gel agarosa elektroforesis untuk memeriksa produk DNA.

Kloning seringkali membutuhkan penyisipan gen ke dalam plasmid, yang merupakan jenis potongan DNA. Enzim restriksi dapat membantu proses tersebut karena overhang beruntai tunggal yang mereka tinggalkan ketika mereka melakukan pemotongan. DNA ligase, enzim terpisah, dapat bergabung bersama dua molekul DNA dengan ujung yang cocok.

Jadi, dengan menggunakan enzim restriksi dengan enzim ligase DNA, potongan-potongan DNA dari sumber yang berbeda dapat digunakan untuk membuat molekul DNA tunggal.