PCR berdiri untuk reaksi berantai polimerase, sebuah teknik biologi molekuler untuk memperkuat segmen DNA, dengan menghasilkan banyak salinan menggunakan enzim DNA polimerase dalam kondisi yang terkendali. Sekecil salinan tunggal segmen DNA atau gen dapat dikloning ke jutaan salinan, memungkinkan deteksi menggunakan pewarna dan teknik visualisasi lainnya.
Dikembangkan pada tahun 1983, proses PCR memungkinkan untuk melakukan Pengurutan DNA dan mengidentifikasi urutan nukleotida dalam gen individu. Metode ini menggunakan siklus termal atau pemanasan berulang dan pendinginan reaksi untuk peleburan dan replikasi DNA. Seiring PCR berlanjut, DNA "baru" digunakan sebagai templat untuk replikasi dan reaksi berantai terjadi, secara eksponensial memperkuat templat DNA.
Teknik PCR diterapkan di banyak bidang bioteknologi termasuk rekayasa protein, kloning, forensik (sidik jari DNA), pengujian paternitas, diagnosis penyakit turunan dan / atau infeksi, dan untuk analisis sampel lingkungan.
Dalam forensik, khususnya, PCR sangat berguna karena memperkuat bahkan jumlah terkecil dari bukti DNA. PCR juga dapat digunakan untuk menganalisis DNA yang berusia ribuan tahun, dan teknik-teknik ini telah digunakan untuk mengidentifikasi segala sesuatu mulai dari mammoth berusia 800.000 tahun hingga mumi dari seluruh dunia.
Prosedur PCR
Inisialisasi
Langkah ini diperlukan hanya untuk DNA polimerase yang membutuhkan PCR start-panas. Reaksi dipanaskan hingga antara 94 dan 96 ° C dan ditahan selama 1-9 menit.
Denaturasi
Jika prosedur tidak memerlukan inisialisasi, denaturasi adalah langkah pertama. Reaksi dipanaskan hingga 94-98 ° C selama 20-30 detik. Ikatan hidrogen templat DNA terganggu dan molekul DNA beruntai tunggal dibuat.
Annealing
Suhu reaksi lebih rendah hingga antara 50 dan 65 ° C dan ditahan selama 20-40 detik. Primer anil ke templat DNA untai tunggal. Suhu sangat penting selama langkah ini. Jika terlalu panas, primer mungkin tidak mengikat. Jika terlalu dingin, primer mungkin mengikat dengan tidak sempurna. Ikatan yang baik terbentuk ketika urutan primer sangat cocok dengan urutan template.
Perpanjangan / Perpanjangan
Suhu selama langkah ini bervariasi tergantung pada jenis polimerase. DNA polimerase mensintesis untai DNA yang sama sekali baru.
Perpanjangan terakhir
Langkah ini dilakukan pada 70-74 ° C selama 5-15 menit setelah siklus PCR terakhir.
Final Hold
Langkah ini opsional. Suhu dijaga pada 4-15 ° C dan menghentikan reaksi.
Tiga Tahapan Prosedur PCR
Amplifikasi Eksponensial
Selama setiap siklus, produk (bagian spesifik DNA yang direplikasi) digandakan.
Tahap Level-off
Ketika DNA polimerase kehilangan aktivitas dan mengkonsumsi reagen, reaksi melambat.
Dataran
Tidak ada lagi akumulasi produk.