Reaksi berantai polimerase (PCR) adalah teknik genetik molekuler untuk membuat banyak salinan gen dan juga merupakan bagian dari proses pengurutan gen.
Bagaimana Reaksi Rantai Polimerase Bekerja
Salinan gen dibuat menggunakan sampel DNA, dan teknologinya cukup baik untuk membuat banyak salinan dari satu salinan gen yang ditemukan dalam sampel. Amplifikasi PCR gen untuk membuat jutaan salinan, memungkinkan untuk deteksi dan identifikasi urutan gen menggunakan teknik visual berdasarkan ukuran dan muatan (+ atau -) dari potongan DNA.
Dalam kondisi terkendali, segmen kecil DNA dihasilkan oleh enzim yang dikenal sebagai DNA polimerase, yang menambahkan deoksinukleotida gratis. (dNTP) ke sepotong DNA yang dikenal sebagai "templat". Bahkan potongan DNA yang lebih kecil, yang disebut "primer" digunakan sebagai titik awal untuk polimerase.
Primer adalah potongan kecil DNA (oligomer) buatan manusia, biasanya panjangnya antara 15 dan 30 nukleotida. Mereka dibuat dengan mengetahui atau menebak urutan DNA pendek di ujung gen yang sedang diamplifikasi. Selama PCR, DNA yang diurutkan dipanaskan dan untai ganda terpisah. Setelah pendinginan, primer mengikat template (disebut anil) dan membuat tempat untuk polimerase untuk memulai.
Teknik PCR
Reaksi berantai polimerase (PCR) dimungkinkan oleh penemuan termofil dan termofilik enzim polimerase (enzim yang mempertahankan integritas dan fungsionalitas struktural setelah pemanasan pada suhu tinggi) suhu). Langkah-langkah yang dilakukan dalam teknik PCR adalah sebagai berikut:
- Campuran dibuat, dengan konsentrasi template DNA, enzim polimerase, primer, dan dNTP yang dioptimalkan. Kemampuan untuk memanaskan campuran tanpa mendenaturasi enzim memungkinkan untuk mendenaturasi heliks ganda sampel DNA pada suhu di kisaran 94 derajat Celsius.
- Setelah denaturasi, sampel didinginkan ke kisaran yang lebih moderat, sekitar 54 derajat, yang memfasilitasi penempelan (pengikatan) primer ke templat DNA untai tunggal.
- Pada langkah ketiga dari siklus, sampel dipanaskan kembali hingga 72 derajat, suhu ideal untuk Taq DNA Polymerase, untuk pemanjangan. Selama pemanjangan, DNA polimerase menggunakan untai tunggal asli DNA sebagai cetakan untuk menambahkan dNTPs komplementer ke ujung 3' dari setiap primer dan menghasilkan bagian DNA untai ganda di wilayah gen yang diinginkan.
- Primer yang telah dianil ke sekuens DNA yang tidak sama persis tidak tetap dianil pada 72 derajat, sehingga membatasi elongasi pada gen yang diinginkan.
Proses denaturasi, annealing dan elongasi ini diulang beberapa kali (30-40) kali, sehingga meningkatkan jumlah salinan gen yang diinginkan dalam campuran secara eksponensial. Meskipun proses ini akan sangat membosankan jika dilakukan secara manual, sampel dapat disiapkan dan diinkubasi dalam a Thermocycler yang dapat diprogram, sekarang biasa di sebagian besar laboratorium molekuler, dan reaksi PCR lengkap dapat dilakukan di 3-4 jam.
Setiap langkah denaturasi menghentikan proses pemanjangan dari siklus sebelumnya, sehingga memotong untaian DNA baru dan menjaganya agar mendekati ukuran gen yang diinginkan. Durasi siklus pemanjangan dapat dibuat lebih lama atau lebih pendek tergantung pada ukuran gen yang diinginkan, tetapi akhirnya, melalui siklus berulang PCR, sebagian besar templat akan dibatasi pada ukuran gen yang diinginkan saja, karena akan dihasilkan dari produk kedua gen yang diinginkan. primer.
Ada beberapa yang berbeda faktor keberhasilan PCR yang dapat dimanipulasi untuk meningkatkan hasil. Metode yang paling banyak digunakan untuk menguji keberadaan produk PCR adalah: elektroforesis gel agarosa. Yang digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran dan muatannya. Fragmen tersebut kemudian divisualisasikan menggunakan pewarna atau radioisotop.
Evolusi
Sejak penemuan PCR, DNA polimerase selain Taq asli telah ditemukan. Beberapa di antaranya memiliki kemampuan "pengoreksian" yang lebih baik atau lebih stabil pada suhu yang lebih tinggi, sehingga meningkatkan spesifisitas PCR dan mengurangi kesalahan dari penyisipan dNTP yang salah.
Beberapa variasi PCR telah dirancang untuk aplikasi spesifik dan sekarang digunakan secara teratur di laboratorium genetika molekuler. Beberapa di antaranya adalah Real-Time PCR dan Reverse-Transcriptase PCR. Penemuan PCR juga telah mengarah pada pengembangan sekuensing DNA, sidik jari DNA dan teknik molekuler lainnya.