Teknik untuk Mengurutkan DNA

Bidang bioteknologi adalah salah satu perubahan yang konstan. Pertumbuhan dan perkembangan riset mutakhir sangat cepat bergantung pada inovasi dan kreativitas ilmuwan dan kemampuan mereka untuk melihat potensi dalam teknik molekuler dasar dan menerapkannya pada yang baru proses. Munculnya reaksi berantai polimerase (PCRmembuka banyak pintu dalam penelitian genetik, termasuk cara Analisis DNA dan identifikasi gen yang berbeda berdasarkan urutan DNA mereka. Pengurutan DNA juga tergantung pada kemampuan kita untuk menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan untaian DNA yang berbeda ukurannya hanya dengan satu pasangan basa.

Pada akhir 1970-an, dua teknik sekuensing DNA untuk molekul DNA yang lebih panjang ditemukan: metode Sanger (atau dideoksi) dan metode Maxam-Gilbert (pembelahan kimia). Metode Maxam-Gilbert didasarkan pada pembelahan spesifik nukleotida oleh bahan kimia dan paling baik digunakan untuk mengurutkan oligonukleotida (polimer nukleotida pendek, biasanya lebih kecil dari 50 basa-panjang). Metode Sanger lebih umum digunakan karena telah terbukti secara teknis lebih mudah diterapkan, dan, dengan Munculnya PCR dan otomatisasi teknik, mudah diterapkan pada untaian panjang DNA termasuk sebagian keseluruhan gen. Teknik ini didasarkan pada pemutusan rantai oleh dideoxynucleotides selama reaksi perpanjangan PCR.

Dalam metode Sanger, untai DNA yang akan dianalisis digunakan sebagai templat dan DNA polimerase digunakan, dalam reaksi PCR, untuk menghasilkan untaian pelengkap menggunakan primer. Empat campuran reaksi PCR yang berbeda disiapkan, masing-masing mengandung persentase tertentu dari analog dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) dengan salah satu dari empat nukleotida (ATP, CTP, GTP atau TTP).

Sintesis untai DNA baru berlanjut sampai salah satu dari analog ini dimasukkan, di mana untai terpotong prematur. Setiap reaksi PCR pada akhirnya akan mengandung campuran panjang untaian DNA yang berbeda, semuanya berakhir dengan nukleotida yang diberi label dideoksi untuk reaksi tersebut. Gel elektroforesis kemudian digunakan untuk memisahkan untaian dari empat reaksi, dalam empat lajur yang terpisah, dan menentukan urutan templat asli berdasarkan panjang helai yang berakhir dengan nukleotida apa.

Dalam reaksi Sanger otomatis, primer digunakan yang diberi label dengan empat tag fluoresen berwarna berbeda. Reaksi PCR, dengan adanya dideoksinukleotida yang berbeda, dilakukan seperti dijelaskan di atas. Namun, selanjutnya, keempat campuran reaksi tersebut kemudian digabungkan dan diaplikasikan pada satu jalur gel. Warna masing-masing fragmen dideteksi menggunakan sinar laser dan informasi dikumpulkan oleh komputer yang menghasilkan kromatogram yang menunjukkan puncak untuk setiap warna, dari mana urutan DNA templat dapat bertekad.

Biasanya, metode urutan otomatis hanya akurat untuk urutan hingga maksimum sekitar 700-800 panjang basa. Namun, dimungkinkan untuk mendapatkan sekuens penuh gen yang lebih besar dan, pada kenyataannya, seluruh genom, menggunakan metode langkah-bijaksana seperti Primer Walking dan sekuensing Shotgun.

Dalam Primer Walking, bagian yang dapat dikerjakan dari gen yang lebih besar diurutkan menggunakan metode Sanger. Primer baru dihasilkan dari segmen urutan yang dapat diandalkan dan digunakan untuk melanjutkan pengurutan bagian gen yang berada di luar jangkauan reaksi asli.

Sequencing senapan mensyaratkan secara acak memotong segmen DNA menjadi lebih tepat (dikelola) ukuran fragmen, mengurutkan setiap fragmen, dan mengatur potongan-potongan berdasarkan tumpang tindih urutan Teknik ini menjadi lebih mudah dengan aplikasi perangkat lunak komputer untuk mengatur potongan-potongan yang tumpang tindih.